Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM?Results
原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅
摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術的現(xiàn)有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應力。我們討論了激發(fā)功率、采集時間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對準精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數(shù)、計數(shù)背景、像素數(shù)、儀器響應函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結論均通過在實際條件下記錄的真實測量數(shù)據(jù)進行演示。
優(yōu)質(zhì)的FLIM圖像
圖1：BPAE樣品的FLIM圖像，2048 x 2048像素，衰減函數(shù)記錄在256個時間通道中。采用bh DCS-120 共聚焦 FLIM 系統(tǒng)，bh SPCImage FLIM 數(shù)據(jù)分析軟件。
是什么造就了一個好的FLIM圖像？它應該具有完美的空間分辨率、足夠高的像素數(shù)、高對比度、低背景噪聲，沒有失焦模糊，并且它應該以高信噪比顯示熒光壽命。如上圖所示。有經(jīng)驗的FLIM用戶可能會補充說，僅僅記錄熒光壽命是不夠的，整個衰減函數(shù)應該記錄在每個像素中。
為什么發(fā)表在科學論文中的FLIM圖像很少看起來像上面的圖像？這實際上沒有任何理由。所有要做的就是使用完美對準的光學元件，正確的顯微物鏡，完美的聚焦，正確的激發(fā)和探測波長，正確的探測器以及一點點耐心。對FLIM的信號處理原理的一些理解也可能有所幫助，這些是每個FLIM用戶都可以實現(xiàn)的。
本文介紹了獲得出色的 FLIM 結果的重要因素，給出的大多數(shù)建議都是微不足道的。然而，差之毫厘，失之千里，正是這些瑣碎事物的總和，使得完美的FLIM結果區(qū)別于平庸的FLIM結果。
第一部分：TCSPC FLIM結果是光子的分布
TCSPC FLIM原理
追求完美FLIM結果的道路始于理解TCSPC FLIM結果是光子的分布，參考文獻[1]。記錄過程的基本原理如圖2所示。
通過高頻脈沖激光束掃描樣品，探測器探測發(fā)射的熒光單光子，并由TCSPC系統(tǒng)測量激光脈沖周期內(nèi)每個光子的到達時間t。同時，TCSPC系統(tǒng)確定激光束在光子探測時刻的空間坐標x，y。從這些數(shù)據(jù)中，光子在空間坐標上和時間上的分布被建立起來。這種光子分布是期望的壽命圖像：它是x*y像素的數(shù)據(jù)陣列，每個像素都包含大量連續(xù)時間通道中的熒光衰減函數(shù)。參見圖 2右。記錄過程及其各種擴展的詳細說明可以在文獻[2]中找到。
圖2：TCSPC FLIM原理
圖3給出了FLIM記錄的光子分布的效果。該圖顯示了 8 個水平 x 128 垂直像素的圖像區(qū)域。每個像素有256個時間通道，包含該像素的衰減數(shù)據(jù)。當然，真實的FLIM圖像具有更高的像素數(shù)。常規(guī)FLIM為采用256至1024個時間通道的512 x512像素的格式，并且已經(jīng)演示過采用256個時間通道的2048 x 2048像素的格式，參考文獻[2]。
對于沒有經(jīng)驗的用戶來說，圖3中所示的分布可能看起來非常“嘈雜”：單個像素中的熒光衰減幾乎看不見。當然，這些“噪聲”不是由探測器或TCSPC電子設備的任何噪聲引起的，它只是一種光子統(tǒng)計的效應，噪聲如此之高的原因是光子分布在大量的像素和時間通道上。因此，每個像素的光子數(shù)都很低，特別是在每個像素中各個時間通道中的光子數(shù)更低。那么，如何降低光子分布中的“噪聲”呢？唯一的方法是記錄更多的光子，見圖4。
圖3：TCSPC FLIM的光子分布。該圖表示 X × Y = 8 × 128 像素的圖像區(qū)域，每個像素有256個時間通道，每個時間通道都包含熒光衰減周期內(nèi)連續(xù)時間的光子。
圖4：與圖3所示的光子分布相同，但記錄的光子多10倍，信噪比高出3.1倍，單個像素中的熒光衰減曲線清晰突出。
信噪比——SNR
從這些數(shù)據(jù)中得出的熒光壽命的信噪比是多少？我們從一個簡單的實驗中獲得答案。
根據(jù)定義，熒光壽命τ是分子保持在激發(fā)態(tài)的平均時間。當一個分子發(fā)出一個光子時，這意味著它從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)。FLIM系統(tǒng)探測單個光子并測量它們相對于激發(fā)脈沖的時間t，如圖5 a和b。當FLIM系統(tǒng)探測到大量這樣的光子時，它們在激發(fā)脈沖后到達探測器的平均時間是分子處于激發(fā)態(tài)的平均時間，即為熒光壽命，見圖5 c。雖然FLIM硬件通常不直接計算平均到達時間，但它存在于光子分布中。
圖5，a和b：光子的探測和激發(fā)后一段時間（t）內(nèi)光子隨時間的分布. c：探測N光子后的光子分布，激發(fā)后的平均到達時間<t>是熒光壽命τ. d：到達時間（t）的標準差σt，是熒光壽命τ。平均到達時間的標準差 στ 為 τ /SQRT(N).
平均到達時間的信噪比是多少？單個光子到達時間的標準偏差στ與熒光壽命τ本身相同，這是指數(shù)函數(shù)的性質(zhì)。如果我們平均大量（ N 個）光子的到達時間，則結果的標準偏差στ隨N的平方根而減小，請參見圖5，d。因此，探測到N個光子后的信噪比，即τ除以其標準偏差στ的比值為：
SNRτ = τ / στ = SQRT (N)
這意味著可以獲得熒光壽命的標準偏差只是衰減曲線中光子數(shù)量的平方根，參考文獻[17]，這在幾個方面是一個了不起的結果。首先，像素壽命的信噪比與像素強度的信噪比相同，這否定了FLIM比穩(wěn)態(tài)成像需要更多的光子（因此需要更多的采集時間）的普遍觀點。其次，信噪比僅取決于N，特別是，不依賴于記錄熒光衰減的時間通道數(shù)。換句話說，您可以增加時間通道的數(shù)量，以提高時間分辨率或減少采樣偽影，而不會影響信噪比。第三，由于SNR僅依賴于N，因此提高壽命精度的唯一方法是增加N。這意味著你要么必須減少像素的數(shù)量 – 你通常不希望 – 或者記錄更多的光子。記錄更多光子是獲得良好FLIM結果的關鍵，也是下一部分的主題。
光子分布的一階矩
如上所述，單指數(shù)衰減（或單指數(shù)衰減近似）的熒光壽命可以通過計算光子的平均到達時間來獲得。如果光子的單個到達時間不可用，則可以通過從完整的光子分布中計算“一階矩” M1 （參考文獻[18]）獲得平均到達時間：
上述等式中的時間t，是光子在FLIM系統(tǒng)的觀測時間間隔內(nèi)的時間，而不是從激發(fā)脈沖之后的時間。因此，必須減去激發(fā)時間（在實踐中是IRF的一階矩）才能得到熒光壽命τ：
τ = M1fluorescence ?M1IRF
該方法如圖2所示。藍點是各個時間通道中的光子數(shù)，綠色曲線是IRF，紅色曲線是通過用IRF卷積指數(shù)函數(shù)e-t/τ來計算的假設熒光衰減函數(shù)。
圖6：熒光壽命的一階矩計算，熒光壽命是熒光的一階矩和IRF的一階矩的差值。
一階矩技術以理想的信噪比提供單指數(shù)衰減的時間。但是，它不會提供多指數(shù)衰減函數(shù)的參數(shù)，并且如果記錄包含背景計數(shù)，或只有一部分衰減函數(shù)位于TCSPC系統(tǒng)的觀測時間間隔內(nèi)，則它不會提供正確的衰減時間。因此，它幾乎完全被曲線擬合技術所取代。然而，一階矩技術有其優(yōu)點：它可在非常低的光子數(shù)下可靠地工作，適用于在線FLIM應用中的快速壽命測定，最重要的是，它提供了一種在理想和非理想條件下估計FLIM信噪比的方法。我們將在本文的后面部分使用到此方法。
SQRT（N）關系的實驗驗證如圖7所示。以不同的采集時間掃描染料溶液，以獲得每像素包含約200，1600和9000個光子的FLIM圖像。典型的衰減曲線如圖7的頂行所示。第二行顯示了單個像素中熒光壽命的直方圖，它是用一階矩分析獲得的，στ 值和σ/τ = SNR 值在直方圖中顯示。從這些值可以看出，σ/τ確實非常接近于SQRT（N）。圖 7 的底行顯示了通過 MLE（最大似然估計）擬合獲得的壽命直方圖。從MLE擬合獲得的壽命直方圖比從矩分析中獲得的直方圖要寬一些，而且MLE結果也接近SQRT（N）的理想信噪比。
圖 7：SQRT （N） 關系的驗證。頂行：來自羅丹明110染料溶液的FLIM數(shù)據(jù)單個像素的衰減曲線。從左到右：N = 200個光子，N = 1600個光子，N = 9000個光子。第二行：通過一階矩方法分析獲得的壽命直方圖。底行：通過 MLE 分析獲得的壽命直方圖。
光子效率
探測到光子并不一定意味著它有效地有助于壽命測量的準確性。它可能因TCSPC模塊中不適宜地選擇的計時參數(shù)而丟失，其探測時間可能因探測器傳輸時間的不確定性而受損，或者可能存在來自背景信號的光子給光子分布增加額外的噪聲。在所有這些情況下，獲得的壽命的SNR都小于理想值SQRT（N）。這種情況可以用“光子效率”E來描述。E的倒數(shù)表示與理想系統(tǒng)相比，非理想系統(tǒng)需要多少光子才能達到相同的信噪比。由于SNR與光子數(shù)的平方根成比例，光子效率也可以寫為
E = (SNRreal / SNRideal)2
光子效率E是“品質(zhì)因數(shù)”的平方，有時用于比較不同壽命測量技術的效率（參考文獻[10，16]）。正確配置的TCSPC系統(tǒng)在最佳條件下工作，其光子效率接近1，達到理想的光子效率將是“最大化光子效率”這一部分的主題。
References
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2. W. Becker, The bh TCSPC handbook, 8th edition. Becker & Hickl GmbH (2019), available online on www.becker-hickl.com. Please contact bh for printed copies.
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