Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM?Results
原文鏈接 by Wolfgang Becker
翻譯 by 譚瓅
摘要：這篇文章試圖幫助bh FLIM技術(shù)的現(xiàn)有和未來用戶從FLIM實驗中獲得最佳結(jié)果。第一部分解釋了TCSPC FLIM的原理，并給出了記錄的光子分布的效果。它表明，測量壽命的信噪比在優(yōu)先取決于記錄的光子數(shù)量。第二部分重點介紹優(yōu)化光子數(shù)，而不增加施加到樣品中的光應(yīng)力。我們討論了激發(fā)功率、采集時間、采集效率、數(shù)值孔徑、聚焦精度、對準(zhǔn)精度和探測器效率的影響。第三部分將重點介紹光子效率。它考慮了TCSPC計時參數(shù)、計數(shù)背景、像素數(shù)、儀器響應(yīng)函數(shù)的影響，以及多指數(shù)衰減函數(shù)的挑戰(zhàn)。最后一部分專門介紹數(shù)據(jù)分析。本文中的所有結(jié)論均通過在實際條件下記錄的真實測量數(shù)據(jù)進行演示。
第四部分：數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)分析無法彌補低質(zhì)量的FLIM數(shù)據(jù)，但可以從樣本和實驗優(yōu)化設(shè)計后采集的數(shù)據(jù)里提取大量信息，詳情參考文獻[3]。以下部分僅介紹幾個要點，并在典型的 FLIM 數(shù)據(jù)上進行了演示。
選擇什么模型擬合?
關(guān)于FLIM數(shù)據(jù)分析的第一個問題通常是：我應(yīng)該使用哪種模型？需要多少個衰減分量才能擬合結(jié)果？
答案并不取決于樣品實際具有的衰減分量的數(shù)量，而是取決于你希望從樣品中找出什么信息。因此，除了你自己，沒有人能回答這個問題。你對特定生物系統(tǒng)中正在發(fā)生的事情有一個假設(shè)，你設(shè)計了一個實驗和一個樣本來確認(rèn)或排除假設(shè)。只有你才能知道樣品中預(yù)期會發(fā)生什么，只有你才能知道衰減函數(shù)中預(yù)計會有多少分量。因此，你應(yīng)該選擇不同的，并具有相應(yīng)衰減分量數(shù)的模型（并且只有這個模型）來擬合數(shù)據(jù)。
比如，你正在做一個蛋白質(zhì)相互作用實驗，采用FRET作為蛋白質(zhì)相互作用的指示，用供體標(biāo)記一種蛋白質(zhì)，用受體標(biāo)記另一種蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)相互作用的地方應(yīng)該發(fā)生FRET，F(xiàn)RET縮短了供體的熒光壽命。因此，您可以在供體發(fā)射波長處獲取FLIM數(shù)據(jù)。在 SPCImage 中加載數(shù)據(jù)并使用單指數(shù)模型運行分析。細胞膜中的熒光壽命最短處 – 正是您預(yù)計的蛋白質(zhì)相互作用的地方（圖30，左）。
您可以檢查圖像的幾個特征點中的衰減函數(shù)。在壽命較短的地方，單指數(shù)模型不能正確擬合衰減函數(shù)，但雙指數(shù)模型適合（圖 30，左二）。這是合理的：首先，并非所有供體分子都對受體具有正確的取向（FRET發(fā)生條件之一）。其次，蛋白質(zhì)相互作用是一種化學(xué)平衡，應(yīng)該有相互作用和非相互作用的供體的混合。這些組分具有不同的壽命，因此衰減曲線應(yīng)該是雙指數(shù)的。
現(xiàn)在，您可以使用雙指數(shù)模型運行數(shù)據(jù)分析。對于顯示，請選擇振幅加權(quán)平均壽命 tm，這是經(jīng)典 FRET 效率的表示，如圖 30 右二所示。接下來，選擇快衰減分量和慢衰減分量的振幅之比，該比值表示相互作用和非相互作用的供體的相對數(shù)量，它在細胞膜中蛋白質(zhì)相互作用的地方最高，見圖30，右圖。結(jié)果表明，雙指數(shù)模型適合擬合數(shù)據(jù)，并且表明初始假設(shè)可能是正確的。
圖 30：FLIM-FRET 測量結(jié)果。從左到右：單指數(shù)壽命圖像，光標(biāo)位置衰減曲線，雙指數(shù)模型的振幅加權(quán)壽命圖像（顯示經(jīng)典FRET強度），振幅比圖像，顯示相互作用蛋白質(zhì)的相對比值）。
選擇要顯示的參數(shù)
SPCImage提供了幾個選項來顯示衰減函數(shù)的參數(shù)：經(jīng)典的單指數(shù)壽命，衰減分量的壽命，振幅加權(quán)平均值和強度加權(quán)平均的分量壽命值，以及衰減分量中包含的相對強度，參考文獻[3]，SPCImage 還顯示這些參數(shù)的比值。如果可能，應(yīng)選擇最清楚地顯示感興趣效果的參數(shù)組合。例如，在 FRET測量中，雙指數(shù)擬合的振幅加權(quán)壽命表示經(jīng)典的 FRET效率，以及振幅之比 a1/a2（相互作用供體的相對比值）。示例如上圖 30 所示。
代謝成像的示例如圖31所示。左圖顯示了自由和束縛NADH的衰減分量的振幅比，該參數(shù)表征細胞的代謝狀態(tài)。分量壽命（t1 和 t2）的圖像顯示在中間和右側(cè)，壽命的不均勻性表明NADH處在單個線粒體中的不同的分子環(huán)境。
圖31：從左到右：活細胞的NADH圖像。振幅比，a1/a2（未束縛/束縛比）以及快衰減分量（t1，未束縛的NADH）和慢衰減分量（t2，束縛的NADH）的圖像。FLIM數(shù)據(jù)格式 512×512像素。底部：選定點的衰減曲線，1024個時間通道，時間通道寬度 10ps。
Binning——“像素合并”
FLIM用戶通常不贊成將壽命數(shù)據(jù)合并，認(rèn)為這是一種不科學(xué)地調(diào)整測量結(jié)果的方式。然而，正確的合并是任何準(zhǔn)確可靠的FLIM數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵。光學(xué)系統(tǒng)成像時，空間分辨率受到衍射極限的限制，單點光的衍射圖稱為Airy圓盤或（在顯微鏡下）點擴散函數(shù)。為了達到衍射極限分辨率，數(shù)據(jù)不得通過像素化來模糊。根據(jù)經(jīng)驗，點擴散函數(shù)的中心圓盤應(yīng)約按 5 x 5像素采樣，當(dāng)然，此區(qū)域內(nèi)像素中的壽命信息非常相似。因此，將這些像素的時間數(shù)據(jù)組合用于FLIM分析是合適的，請參見圖32左。結(jié)果是光子數(shù)大幅增加，壽命精度相應(yīng)提高。請注意，合并5 x 5像素區(qū)域會使凈光子數(shù)增加25倍！
在 SPCImage 軟件中，通過組合定義合并區(qū)域的數(shù)據(jù)并將凈衰減曲線分配給中心像素來執(zhí)行合并。因此，圖像中的有效像素數(shù)不會改變，該程序還符合優(yōu)質(zhì)圖像的美學(xué)角度。從視覺上看，圖像在開始看起來很丑陋之前，包含大量的強度噪聲。然而，在FLIM應(yīng)用中，壽命數(shù)據(jù)中相同數(shù)量的噪聲將使數(shù)據(jù)無用。因此，在具有一定強度噪聲的大量像素下顯示圖像是有意義的，但壽命平均在更大的區(qū)域內(nèi)，并且相應(yīng)地增加了信噪比。
SPCImage 中的像素合并原理如圖 32 右所示。
圖 32：左：對強度圖像中的 Airy 圓盤進行過采樣，以及合并像素用于壽命計算。右：用于壽命計算的像素重疊合并。
SPCImage 軟件中合并參數(shù)（binning parameter） n 的含義如圖 33 所示。請注意，合并系數(shù)2對應(yīng) 5 x 5 像素區(qū)域，即大致對應(yīng)于正確采樣圖像中點擴散函數(shù)的面積。無意中，圖像通常使用較高的過采樣率拍攝，尤其是在使用掃描儀的高變焦系數(shù)時。因此，SPCImage提供合并系數(shù)最多為10像素合并，對應(yīng) 20 x 20 的像素區(qū)域。
圖 33：合并系數(shù)n的功能，‘Square’（左）和‘Circular’ （右）合并。
圖 34 給出了像素合并（binning）效果的演示，用512 x 512像素掃描BPEA樣品，將衰減曲線記錄到1024個時間通道中。未做像素合并的數(shù)據(jù)如圖 34 的頂行所示。左側(cè)顯示了（單指數(shù)）壽命圖像。在不進行像素合并的情況下，每個像素的光子數(shù)量極低，請參閱中圖。因此，壽命圖像看起來很嘈雜，衰減時間散布在各處，請參閱右側(cè)的壽命直方圖。圖 34 的底行顯示了使用像素合并的數(shù)據(jù)。采用圓形合并，合并系數(shù)為 2，對應(yīng)21 個像素區(qū)域的合并。壽命圖像質(zhì)量優(yōu)異，凈衰減函數(shù)具有足夠的光子以進行合理擬合，并且壽命直方圖具有合理的寬度。從圖像中可以看出，顏色不會模糊，即像素合并不會對整個壽命的空間分辨率造成明顯的損失。
圖 34：像素合并（binning）在壽命分析中的影響。512 x 512 像素，1024 個時間通道。頂部：無合并。底部：合并系數(shù) 2，圓形合并，21個像素的衰減曲線的總和用于中心像素的分析。
合并系數(shù)為2（將21個像素的衰減曲線合并到中心像素中，見圖33），合并后的數(shù)據(jù)甚至足以進行雙指數(shù)衰減分析。結(jié)果如圖 35 所示，頂行從左到右顯示了快衰減分量和慢衰減分量的壽命圖像，以及兩個分量振幅之比的圖像。這三幅圖像在空間分辨率和壽命分辨率方面都具有良好的質(zhì)量。底行顯示參數(shù)直方圖，它們表明，分量壽命和振幅比是在良好的信噪比下獲得的（請注意不同的參數(shù)范圍）。
圖 35：與圖 34 中底行數(shù)據(jù)相同，雙指數(shù)衰減分析。從左到右：快分量的壽命圖像t1，慢分量的壽命圖像t2，振幅比圖像a1/a2。請注意不同的參數(shù)范圍。
圖36顯示了合并對壽命信息的空間分辨率的影響。該圖顯示了圖34和圖35中大細胞中心70 x 70像素區(qū)域的數(shù)據(jù)。正如預(yù)期的那樣，在合并系數(shù)≤2時，壽命對比度基本保持不變，請參考中心的花狀結(jié)構(gòu)。對于 4 和 6（右2和右1）的合并系數(shù)，壽命對比度開始降低。來自相鄰像素的太多衰減數(shù)據(jù)被混合到凈衰減函數(shù)中，因此，中間的結(jié)構(gòu)越來越多地采用其更周圍緊鄰環(huán)境的壽命值。
圖36：放大圖34數(shù)據(jù)的70 x 70像素區(qū)域，顯示大細胞的中心。不同的合并系數(shù)，從左到右的n= 0、1、2、4 和 6。在 bin ≤2（中心圖像），使用壽命對比度保持不變。它在 bin = 4 和bin = 6 時壽命對比度會降低，這可以從中心結(jié)構(gòu)顏色的褪色中看出。
圖像分割
與合并空間相關(guān)像素合并（binning）相比，圖像分割是組合了具有類似衰減特征的像素。
該過程如圖37左上所示，圖37顯示了SPCImage面板，其中包含低光子數(shù)的FLIM數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)與圖 34 上行中的數(shù)據(jù)相同，所選像素中的衰減數(shù)據(jù)顯示在面板的右下角。根據(jù)這些數(shù)據(jù)計算出的壽命圖像是嘈雜的，并且壽命的直方圖（右上）非常寬。下一步如圖 37（右上方）所示。相量圖（phasor plot）是根據(jù)數(shù)據(jù)計算得出的，不出所料，相量分散在各處。
然而，壽命明顯不同的像素的相量（由顏色表示）出現(xiàn)在不同的相位/振幅位置。
在第三步中，選種一系列相量值，并在壽命圖像中突出顯示相應(yīng)的像素，請參見圖 37 左下角。可以移動選擇區(qū)域，更改其大小和形狀以突出顯示圖像中的所需結(jié)構(gòu)。在所示的示例中，已選擇細胞的線粒體。即使選擇可能不完整，所選像素也都在圖像的所需結(jié)構(gòu)內(nèi)。
在最后一步，圖37，右下角，所選像素的衰減數(shù)據(jù)被組合成一條衰減曲線，這條曲線包含超過300萬個光子。相比之下，圖34中單個像素中只有幾百個光子，在n=2的合并區(qū)域中大約有3000個光子。具有300萬光子的衰減曲線可以進行高精度分析，三指數(shù)分析很輕松，如圖 37 右下角所示，三指數(shù)衰減參數(shù)顯示在面板的右上方。
圖37：通過相量圖進行圖像分割，并將所選像素組合成高光子數(shù)的單衰減曲線。
固定分量的壽命進行分析
如果減少衰減參數(shù)的數(shù)量，多指數(shù)衰減分析將變得更加容易。因此，在數(shù)據(jù)分析中包括先驗知識可以減少結(jié)果中的噪聲。圖38顯示了小鼠開放性腫瘤的NADH圖像，用bh DCS-120 MACRO系統(tǒng)成像，有趣的參數(shù)是快速衰減分量的振幅a1。它代表游離NADH的比例，并指示組織相應(yīng)區(qū)域的新陳代謝類型。因此，使用雙指數(shù)模型對數(shù)據(jù)進行分析，并創(chuàng)建了a1圖像。使用所有參數(shù)（t1，t2，a1，a2）自由浮動來分析左側(cè)的圖像，固定t2分析右側(cè)的圖像。不出所料，右側(cè)的圖像噪點較小，腫瘤在圖像和a1直方圖中都更清晰地突出。右側(cè)的直方圖甚至顯示兩個不同的像素群，一個為 a1 = 0.65，另一個為 a1 = 0.83，這些正是通常在健康組織和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的振幅。
圖38：小鼠腫瘤的NADH圖像顯示快速NADH成分的振幅a1。左：T1、t2、a1、a2浮動。右：t2 固定為最常用值，2400 ps。下行：圖像像素上 a1 的直方圖。
在衰減分量的壽命預(yù)計恒定的情況下，使用固定參數(shù)進行分析可以大大降低噪聲。但是，必須謹(jǐn)慎使用該技術(shù)，熒光壽命從來都不是絕對恒定的，分子環(huán)境總是有影響的。如果分量壽命是固定的，但不是絕對恒定的，則擬合過程會以其他參數(shù)的較大變化來響應(yīng)。因此，在固定分量壽命條件下，獲得的擬合結(jié)果可能具有較大的系統(tǒng)誤差。
最后一步：圖像強度和參數(shù)范圍
FLIM圖像應(yīng)清晰明了地展示相關(guān)論文中聲稱的科學(xué)事實，圖像不僅應(yīng)顯示正確的衰減參數(shù)，還應(yīng)將其顯示在適當(dāng)?shù)膹姸群退p參數(shù)范圍內(nèi)。默認(rèn)情況下，SPCImage 使用強度自動縮放，在正常情況下，自動縮放會產(chǎn)生合理的圖像。但是，自動縮放功能無法知道圖像的哪個部分是包含感興趣信息的部分。如果信息位于圖像的暗淡區(qū)域，則自動縮放不一定能提供最佳圖像。此外，其他完美的圖像也可能包含一些過于明亮的點。在這些情況下，無論它們來自何處，自動縮放都不會生成合理縮放的圖像，因此，應(yīng)關(guān)閉自動縮放，并手動調(diào)整強度刻度。圖39 顯示了一個示例，自動縮放（左）會導(dǎo)致不良的縮放強度范圍，手動調(diào)整強度范圍可生成正確平衡的圖像（右圖）。
具有不同參數(shù)比例的圖像的顯示如圖40和圖41所示，這些圖像顯示了分別以藍-綠-紅和紅-綠-藍兩色方向顯示的壽命圖像。參數(shù)范圍為 2000 到 3000 ps（左）和 2300 到 2700 ps（右）。哪種風(fēng)格最能體現(xiàn)感興趣的效果，必須根據(jù)具體情況來決定。
圖39：包含一些非常亮點的圖像。左：強度范圍的自動縮放，自動縮放功能可將強度縮放到最亮的特征，獲得的強度范圍不適合圖像的其余部分。右：手動縮放可在正確的強度范圍內(nèi)生成圖像，單指數(shù)擬合的壽命，顏色范圍從2000 ps（藍色）到 3000 ps（紅色）。
圖40：圖39所示數(shù)據(jù)的不同表示形式，單指數(shù)壽命，手動強度縮放。左：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 b-g-r，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。
圖 41：圖 39 中所示數(shù)據(jù)的不同表示形式，單指數(shù)壽命，手動強度縮放。左：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2000 至 3000 ps。右：顏色方向 r-g-b，顏色范圍為 2300 至 2700 ps。
總結(jié)
熒光壽命可以從TCSPC FLIM數(shù)據(jù)中得出，信噪比接近每像素光子數(shù)的平方根。因此，表征FLIM數(shù)據(jù)質(zhì)量的最重要參數(shù)是光子數(shù)。通過使用實際示例，我們已經(jīng)證明，通過簡單地優(yōu)化探測效率和采集時間，可以獲得光子數(shù)為10倍。通過使用高效率的探測器，可以增加4倍，優(yōu)化的像素合并策略可以增加25倍。總而言之，這是光子數(shù)為1000倍、信噪比為32倍的提升。我們并不是說在所有情況下都可以達到如此大的改進，但幾乎在任何時候都可以實現(xiàn)相當(dāng)大的改進。
FLIM系統(tǒng)的第二個重要參數(shù)是光子效率，光子效率描述了系統(tǒng)探測到的單個光子對結(jié)果的貢獻程度。換句話說，它描述了系統(tǒng)與理想信噪比SQRT（N）的接近程度。雖然TCSPC系統(tǒng)接近理想，但光子效率通常可以通過使用正確的TCSPC定時參數(shù)，避免記錄背景信號以及使用足夠快IRF的探測器來優(yōu)化。通常，光子效率提高兩到四倍是可能的，只需遵守一些簡單的信號記錄規(guī)則即可。
當(dāng)記錄和分析多指數(shù)衰減函數(shù)時，數(shù)據(jù)質(zhì)量變得尤為重要。在最常見的FLIM應(yīng)用中，多指數(shù)衰減是必須的。然后，信息主要在于衰減分量的振幅和壽命，而不是凈衰減函數(shù)的表觀壽命。這意味著不僅探測效率和光子效率很重要，儀器響應(yīng)函數(shù)IRF的寬度也很重要。此外，解析多指數(shù)衰減函數(shù)的選項在很大程度上取決于衰減函數(shù)的形狀，它們偏離單指數(shù)曲線的距離越大，就越能很好地分辨它們。因此，考慮好FLIM選項的實驗規(guī)劃和樣品優(yōu)化設(shè)計可以對研究的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。
最后，數(shù)據(jù)分析在任何FLIM實驗中都起著重要作用，正確應(yīng)用的數(shù)據(jù)分析可以從記錄的數(shù)據(jù)中提取最大數(shù)量的信息。此外，它能夠以出版就緒的風(fēng)格呈現(xiàn)數(shù)據(jù)，令人信服地支持相關(guān)出版物中提出的科學(xué)主張。
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